2022/08/01
細菌に汚染された胚を救出する新しい方法
A new method to rescue embryos contaminated by bacteria – F&S Reports (fertstertreports.org)
目的：細菌汚染の影響を受けた胚の妊娠に成功した症例を報告すること。
症例：卵管閉塞を有する31歳の不妊患者。体外受精の際、胚の細菌汚染に直面しました。
介入：細菌に汚染された胚の透明帯（ZP）を酸性タイロード溶液で除去しました。ZPを除去した胚は、5日目まで1ウェルあたり1胚でタイムラプス培養ディッシュで培養し、ZPを除去した胚盤胞1個を移植用に選択しました。
主要評価項目：細菌汚染の再発を伴わない胚の取得率、胚の発生能など。
結果：20個の卵子を採取し、精子と培養器内で一晩培養しました。2PN胚が9個、1PN胚が3個得られました。残念ながら、すべての胚はKlebsiella pneumoniae細菌に汚染されていました。7個の胚のZPを酸性タイロード溶液で除去し（ZP除去群）、残りの5個の胚と3個のMII期卵をG-1 PLUS培地で複数回洗浄しました（洗浄処理群）。洗浄処理群では、すべての胚が2日目に再汚染を受け、3日目には死滅しました。ZP除去群では、2日目に2個の胚の再汚染が認められました。汚染されずに残った5個の胚を胚盤胞培養に選択しました。5日目に、培養した胚のうち2個が胚盤胞に到達しました。1個の胚盤胞は新鮮胚周期に移植され、もう1個は凍結されました。移植後4週目に1個の子宮内妊娠が確認されました。患者は妊娠中に子宮内感染の発生はなく、妊娠30週です。
結論：透明帯除去は、細菌に汚染された胚を救出するための安全で効果的な方法です。
はじめに
胚培養中の細菌汚染は、すべての体外受精（IVF）施設において直面する深刻な問題です。これまでの報告によると、微生物汚染の頻度は0.35％から0.86％です。微生物汚染の頻度は1％未満ですが、発生すると胚移植ができなくなるため、深刻な問題です。体外受精における微生物汚染による被害は、そのまま患者さんの経済的・心理的負担になります。体外受精は毎年世界中で行われており、生殖補助医療における合併症として、微生物汚染は軽視できません。従って、IVF施設にとって、細菌汚染を防ぐことは最も重要なことです。また、汚染された胚をどのように救済するかも同様に重要です。
現在、最も一般的に行われている方法は、抗生物質を含む培地で胚を十分に洗浄し、胚の表面から微生物を除去することです。しかし、卵子を包んでいる透明帯は多孔質な網目構造をしているため、完全に微生物を除去することは難しい場合があります。また、洗浄後であっても、再び細菌汚染が発生することがあります。本研究では、細菌汚染された胚からZPを除去することにより、細菌による再汚染を防止することに成功しました。これは汚染された胚を救出し、最終的に妊娠を成功させる新しい方法です。
症例報告
今回の症例は31歳女性で、3年前から続発性不妊症の既往があり、生理は規則正しく来ていました。彼女の右卵管は遠位閉塞、左卵管は部分閉塞でした。卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、エストラジオール、抗ミューラー管ホルモンの基礎値、および夫の精液検査は正常でした。ロング法を用いて調節卵巣刺激をしました。
精子の調製と媒精の手順は、以前の通りでした。簡単に言いますと、男性は精液採取の前に石鹸で手と陰茎を洗い、アルコールで手を消毒しました。精液検体は自慰行為により採取し、沈殿した精子を回収して2回洗浄することにより、勾配遠心分離を介して精子を選択しました。体外受精に使用した精子の最終濃度は1.0×105/mLでした。本研究で使用した精液調製用培地はG-IVF PLUS（Vitrolife、10136）およびSpermGrad（Vitrolife、10099）でした。SpermGradは抗生物質を含みませんが、G-IVF PLUSなど希釈や精子洗浄に用いる培地には、抗菌剤としてゲンタマイシンが含まれています。
20個を採卵し、16〜20時間かけて一晩精子と接触させました。1日目の受精結果を表1に示します。前核が2個ある胚（2PN）が9個、前核が1個ある胚（1PN）が3個得られました。最初の3日間、胚はG-1 PLUS培地（Vitrolife、10128）で培養されました。次に、胚盤胞培養のために、胚を G-2 PLUS 培地（Vitrolife，10132） に移しました。
本研究で使用した胚培養液は、特に断りのない限り、抗生物質としてゲンタマイシンを含有しています。
受精後１日目に受精ディッシュに白濁した粒子が観察され、多数の精子が不動であることに気付きました。このことから、受精ディッシュに細菌が混入したことが疑われました。卵への授精に使用した精液懸濁液、卵胞液、体外受精用培地を回収し、医学微生物学教室に送付して微生物学的検査を行いました。
検査の結果、汚染された微生物はKlebsiella pneumoniaeであることが判明しました。ただし、卵胞液検体からはEnterococcus faecalisが検出されましたが、精液検体からは菌が検出されませんでした。その後、各胚をG-IVF培地で数回洗浄し、G-1 PLUS培地で胚1個に対して培養液1滴の割合で培養しました。それにもかかわらず、1日目の午後にはすべての胚培養液滴に細菌が存在しました。再度洗浄しても効果がない可能性があるため、患者の同意を得た上で、一部の胚のZPを除去しました。
2PN胚6個と1PN胚1個のZPは、G-1 PLUS培地で数回洗浄後、酸性タイロード溶液（Sigma, T1788）により除去しました（ZP除去群）。次に、このZP除去胚を、G-1 PLUS培地を用いたタイムラプス培養ディッシュ（CultureCoin, ESCO,1821072, Singapore）にて培養しました。続いて、この培養ディッシュを以下の条件で培養しました：6%CO2、5%O2、89%N2、37℃のタイムラプス培養器（Miri, ESCO, Singapore）で、1ウェルあたり胚1個を培養しました。この培養ディッシュは底が狭いため、割球の動きが制限され、外からの妨害も制限されます。残りの2PN胚3個、1PN胚2個、MII期卵3個を含む胚は、G-1 PLUS培地を用いて数回洗浄した後、G-1 PLUS培地を含む35mm培養ディッシュで1胚／ドロップで培養しました（洗浄処理群）。洗浄処理群の胚は、5% CO2，5%O2，89%N2を含む37℃，飽和湿度のインキュベータで培養しました。洗浄処理群では、すべての胚が2日目に再汚染され、3日目には死滅しました。ZP除去群では、7個の胚のうち2個が2日目に再汚染を受け、発育が阻害され3日目までに死亡しました。残りの5個の胚は汚染されておらず、3日目にG-2 PLUS培地に移植されました。培養胚2個は5日目までに胚盤胞に発育したため、1個は新鮮周期の5日目に移植し、もう1個は凍結保存しました。胚移植後、抗生物質は処方されませんでした。黄体補充は1回400mgを1日2回膣内カプセルで投与しました。黄体補充は妊娠12週まで継続しました。
胚移植後4週目に経腟超音波検査で子宮内単胎妊娠を確認しました。この患者は妊娠30週目であり、この間、子宮内感染は発生していません。
この方法の有効性を確認するため、廃棄された胚の一部を大腸菌に感染させました。合計14個の3PN胚を大腸菌を含む培地で培養し、翌日、大腸菌に汚染されていました。これらの胚を、7個ずつの2群に無作為に分けました。各群を72時間培養し、毎日、胚培養液滴中の菌の増殖を観察しました。洗浄処理群では、処理翌日に7個すべての胚が再び大腸菌汚染に見舞われました。一方、ZP除去群では、培養3日後でも細菌の増殖は見られず、胚盤胞の崩壊・分離もなく胚の形態が維持されていました。
議論
本研究では、汚染された胚のZPを除去することにより、細菌による胚の再汚染を防ぎ、その結果、妊娠を成立させることができました。これは、汚染された胚を救済し、最終的に妊娠を成立させる新しい方法であると考えます。他の1つの報告では、体外受精の培養中に汚染された凍結胚盤胞のZPを除去し、ZPのない胚盤胞を移植して臨床妊娠を成功させました。しかし、この研究におけるZPの除去は、汚染が発見された日ではなく、胚移植の直前に行われました。
私たちの場合、胚培養液に混入していた微生物はK. pneumoniaeでした。
しかし、卵胞液からはE. faecalisが検出され、精液からは菌が検出されませんでした。
いくつかの研究では、ドナーの生殖管の微生物叢以外に、作業環境や不適切な操作が汚染の原因である可能性が示唆されています。
したがって、微生物は職場の周囲の空気や、今回実施した体外処置の際に不用意に混入したものが起源である可能性があります。
増殖の過程で発生する細菌内毒素は、胚の発育に重大な影響を与えます。
胚の断片化や突起形成を引き起こすほか、妊娠率も低下させます。
そこで、細菌に汚染された胚を抗生物質を含む培地で洗浄し、胚の表面から微生物を除去しようとするのが、胚の救済方法です。
これまでの研究では、洗浄液に外因性ペニシリン（31.5 IU/mL）とストレプトマイシン（10 μg/mL）またはゲンタマイシン（0.15 g/L）を添加することにより、細菌の増殖を抑制することができることが分かっています。
しかし，これは胚の汚染除去に最も効果的な方法とはいえないかもしれません。
我々の以前の研究では、この方法で処理した後、移植可能な胚があったのは汚染42例中7例のみでした。
この結果については、培養液中の細菌量が多かったか、適用した抗生物質感受性試験の精度が低かったかの2つの可能性があります。
細菌感受性検査は通常、結果が出るまでに数日を要するため、胚の汚染を回復させるための抗生物質の選択は主観的なものにならざるを得ません。
ヒトのZPは、主に4つの糖タンパク質（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4）から構成されています。
ZPの外表面は、細孔とコンパクトなメッシュが規則的に交互に並ぶ、細く相互に結合したフィラメントの繊細なネットワークで構成されています。
細孔は、ZPマトリックスの内面よりも外面の方が大きく見えるため、“スポンジ状 ”の外観を呈しています。
これは、微生物がZPの表面に付着しやすいことも意味します。
そのため、ZPの表面に付着した微生物を洗浄で除去することが困難な場合があります。
そこで、洗浄で除去できなかった胚のZPを除去することにしました。
興味深いことに、ZPを除去した7個の胚のうち5個は再汚染が観察されませんでしたが、洗浄処理群ではすべての胚が再汚染に見舞われました．
さらに、再汚染が起こると、胚の周囲で細菌が増殖し始め、ZPが細菌の運搬役となり、洗浄だけでは細菌の除去が困難であることがタイムラプス観察から分かりました。
ZPは、卵形成、受精、着床前発生において、重要な役割を担っていることは特筆に値します。
ZPは、胚の空間構造を維持するために非常に重要であり、圧縮が起こり、胚芽が互いに分離するのを制限する前に、胚の空間構造を維持します。
そのため、胚盤胞の移動を制限し、外からの悪影響を抑制するために、ZP除去胚には独立したウェルを持つ培養ディッシュが推奨されます。
本研究では、過去に細菌汚染された胚を用いた妊娠を安全かつ成功裏に支援するための新規方法を利用しました。
この方法は、細菌汚染された胚をタイムリーに救出し、新鮮周期での胚移植を可能にし、凍結・融解過程での損傷の可能性を防止することができました。
「細菌に汚染された胚を救出する新しい方法」 津田沼IVFクリニック | tsudanuma-ivf-clinicのブログ (ameblo.jp)